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    ChIP-seq
    ChIP-seq

    一、产品概述

    1.1 什么是ChIP-seq 

    ChIP-seq技术结合染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,ChIP)与高通量测序澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具澳洲幸运5正规官网网址,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究澳洲幸运5正规官网网址。

    1.2 产品功能

    ChIP-seq技术是将ChIP与高通量二代测序结合,从基因组范围内检测组蛋白澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、转录因子等蛋白质结合的DNA区段澳洲幸运5正规官网网址。研究转录因子及其他与染色质相关的蛋白如何影响表观调控,检测在一些生物过程与疾病中,DNA与蛋白质相互作用调控基因表达的重要性澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。结合生物信息学分析澳洲幸运5正规官网网址,能够找到转录因子下游调控的靶基因,为进一步阐明生物学机制提供依据。      

    1.3 技术优势 

    1. 全基因组覆盖:ChIP-Seq可在全基因组范围单碱基水平对蛋白结合位点进行筛选与鉴定澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。

    2. 高灵敏度:每个样本可获得数百万条的序列标签,可发现研究基因组上稀有的蛋白结合位点。

    3. 高精确率:可获得高水平的信噪比数据澳洲幸运5正规官网网址,准确区分真实事件与噪音澳洲幸运5正规官网网址,精确定位蛋白结合位点澳洲幸运5正规官网网址。

           
    1.4 实验简介 

    1.4.1实验原理     

     首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段澳洲幸运5正规官网网址,并对其进行纯化与文库构建澳洲幸运5正规官网网址;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。
          
     应用:(1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址;

         (2)检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址;

         (3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址;

         (4CTCF转录因子研究。        

    1.4.2 实验流程

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    获得样品后,首先是细胞核的提取。细胞样品无需此操作澳洲幸运5正规官网网址,组织样品要经过研磨处理,将组织块处理成单个细胞或细胞核澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。随后是蛋白质和DNA的交联澳洲幸运5正规官网网址,使得转录因子紧密的结合在与DNA相互作用的位置澳洲幸运5正规官网网址,便于后续操作澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。紧随着是DNA片段化处理澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,这一步将DNA随机打断,既照顾了测序仪的读长要求澳洲幸运5正规官网网址,也使得测序更加精确。理想的片段长度为1-3个核小体(150-500bp)。片段化处理之后的样品澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,经过特异性的抗原抗体结合反应被免疫沉淀下来,而没有结合的DNA蛋白质复合体则被洗掉。
          IP下来的DNA通过连接测序接头和可以识别的条码序列澳洲幸运5正规官网网址,被制备成了可以用于二代测序的文库。同时片段化后的总DNA也被制备成文库澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,作为分析的参考澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。

     

    二澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、嘉因生物参与完成的典型案例

    2.1 转录因子的ChIP-seq案例
            案例一

            EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer. (EMBO J, 2016) 
           EglN2/PHD1是一个对乳腺癌发生有重要作用的氧感知器(oxygen sensor)澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。越来越多的研究表明在氧感知(oxygen sensing)和线粒体作用上两者有功能上配合(cross talk)澳洲幸运5正规官网网址,并且两者在维持肿瘤生长上都有很关键的作用。这篇文章向我们展示了EglN2敲除会降低在常氧和缺氧状态下乳腺癌中线粒体的呼吸。进一步整合分析RNA-seqEglN2在缺氧状态下ChIP-seq数据 我们发现:NRF1EglN2激活的基因上有motif 富集澳洲幸运5正规官网网址,这暗示了NRF1可能是EglN2的共结合因子(binding partner)。进一步,我们通过ChIP-seq数据验证了 EgLN2NRF1的相互结合澳洲幸运5正规官网网址?澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址;粕?,通过在染色质上形成EglN2/PGC1alpha/NRF1激活复合体澳洲幸运5正规官网网址,EglN2激活了FDXR的转录并保持了线粒体的功能。进一步,FDXR作为EglN2的一个下游靶基因(effector),导致了乳腺癌的发生in vitro/ in vivo. 作者的发现暗示了EglN2调控了ERalpha阳性乳腺癌中线粒体的功能。

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    2.1 案例实验图

     

    案例二

    Inactivation of PBX3 and HOXA9 by down-regulating H3K79 methylation represses NPM1-mutated leukemic cell survival (Theranostics澳洲幸运5正规官网网址,2018)

    约1/3的急性髓系白血舶闹扌以?正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。ˋML)患者存在NPM1 突变(NPMc+),但是澳洲幸运5正规官网网址,对于NPM1突变在AML发病中的分子机制尚不清楚。本研究首先分析了TCGA数据,表明在NPMc+白血病中PBX3和HOXA9存在高表达澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,在白血病发病过程中有重要作用。为了验证NPM1突变是否可以通过表观遗传学来调控白血病的发病进程澳洲幸运5正规官网网址,检测了NPMc+白血病细胞中H3K4me2澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、H3K9me2、H3K27me2、H3K36me2澳洲幸运5正规官网网址、H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3的甲基化水平澳洲幸运5正规官网网址,认为H3K79的甲基化与NPMc+的转录活性有关。为了验证PBX3和HOXA9的表达是否受到H3K79甲基化的影响澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,通过ChIP-seq分析NPMc+ MEFs/WT和OCI-AML2/OCI-AML3的H3K79me2发现HOXA9的表达受到H3K79me2直接调控,但是PBX3没有直接作用澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。PBX3是HOXA的辅助因子,通过敲除HOXA9澳洲幸运5正规官网网址,发现PBX3的表达显著下调澳洲幸运5正规官网网址,但是没有影响H3K79me2澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,而PBX3的敲除澳洲幸运5正规官网网址,没有影响HOXA的表达澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。最后澳洲幸运5正规官网网址,验证DOT1L小分子抑制剂EPZ5676的作用机制澳洲幸运5正规官网网址,发现会引起HOXA9,PBX3 和H3K79me2的下调澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,诱导NPMc+白血病的自噬,DOT1L通过抑制组蛋白H3K9甲基化从而参与NPMc+白血病澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。

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    2.1 案例实验图



    2.2 组蛋白修饰的ChIP-seq案例
            Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement  (PNAS, 2018) 
          Dnmt3a是造血系统中表观遗传学的修饰基因和癌症的抑制基因澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。Dnmt3a 878H是急性髓样白血舶闹扌以?正规官网网址。?/span>AML)中常见突变体澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。本研究采用条件性敲击的方法发现Dnmt3a R878H不足以引起AML澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。通过单细胞测序(single-cell RNA-seq)结合甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)发现Dnmt3a R878H/WTDnmt3aWT/WT的低甲基化和超甲基化区域澳洲幸运5正规官网网址,通过基因注释发现不同甲基化区域(DMRs)的富集通路参与多能性干细胞和慢性粒细胞白血?澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。?/span>CML)调控澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,联合RNA-seq发现Dnmt3a R878H/WT诱导的低甲基化有助于mTOR上调澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。MeDIP分析显示白血病细胞的mTOR基因主体低甲基化澳洲幸运5正规官网网址。通过RNAi等发现mTOR的上调使CDK1的水平增加,CDK1介导EZH2的磷酸化水平增加来抑制H3K27me3的甲基化水平澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。通过ChIP-seq分析Dnmt3aR882H/WTDnmt3aWT/WTH3K27me3发现Dnmt3aR882H/WTH3K27me3甲基化水平和富集程度低于Dnmt3aWT/WT澳洲幸运5正规官网网址。明确mTOR pathway的激活作为一个疾病机制的关键调节剂并且可以通过mTOR来抑制Dnmt3a突变体相关的白血病的潜在治疗效应澳洲幸运5正规官网网址。

     

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    2.2 案例实验图

     

    三澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、其他应用案例

           案例一
           FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAS, 2016)
           植物分生组织对植物组织和器官的形成是必要的。转录因子FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 (FHY3)是已知的拟南芥生长阶段发挥多重作用,但是它的功能在生殖生长期是不知道的。作者通过对fhy3突变体进行表型分析发现,FHY3在花分生组织决定和茎端分生组织的维持中都具有重要作用。通过ChIP-seqRNA-seq数据分析发现在花发育过程中有238FHY3直接结合并转录调控的靶基因(其中138个在fhy3-68突变体中是转录上调的澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,100个是转录下调的)澳洲幸运5正规官网网址。根据特异结合位点澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,作者发现了52个花特异的FHY3靶基因澳洲幸运5正规官网网址,其中63%33个基因)在fhy3-68突变体中是上调的澳洲幸运5正规官网网址,进一步显示FHY3在花发育中的转录抑制作用。作者进一步证实了CLV3澳洲幸运5正规官网网址、SEP1SEP2都是FHY3的靶基因澳洲幸运5正规官网网址。在茎尖分生组织中,FHY3直接抑制CLV3,从而调控WUS来维持干细胞池澳洲幸运5正规官网网址。在花分生组织中,FHY3直接抑制CLV3澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,而且激活了SEP2来促进花分生组织决定。而且,作者通过遗传分析证实了两个分生组织建立和维持的关键因子WUSCLV3作用于FHY3的下游澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。

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    3.1 案例实验图

          

            案例二    

        H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017)
        文章通过拟南芥H3K27me3 和H2AK121ub的ChIP-seq实验和数据澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,回答了一个悬而未决的植物领域表观遗传的问题澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,到底组蛋白修饰H2AK121ub是否需要转录因子PRC2的活性。经典模型认为澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,PCR2介导的H3K27me3是 招募PRC1形成H2AK121ub的不可或缺的一步,也就是说PCR2的活性是H2AK121ub形成所必须的。但是作者发现澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,在很多情况下澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,广泛存在的组蛋白修饰H2AK121ub与H3K27me3的分布无关(H3K27me3是由PCR2介导发生的)。通过一系列后续实验澳洲幸运5正规官网网址,作者认为在很大程度上来说 H2AK121ub的形成与PRC2的活性无关澳洲幸运5正规官网网址。

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    3.2 案例实验图

           

            案例三      

            SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015澳洲幸运5正规官网网址,IF=11.3)
           小鼠胚胎干细胞中SETDB1独立调节H3K9me3过程中发育相关基因PRC2活性 
           SETDB1是一种促进H3K9 甲基化修饰的组蛋白甲基转移酶。作者首先用ChIP-seqH3K9me3做了4个重复,结合前人的SETDB1ChIP-seq 实验数据进行比对澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,得到了两种SETDB1peaks位点:solo peaksensemble peaks澳洲幸运5正规官网网址。ensemble peaks位点附近有H3K9me3峰值澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,而solo peaks附近没有澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。对solo peaks位点靶基因进行GO分析,发现大部分基因富集在神经发育调节功能中澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,而这部分基因又与核心蛋白复合体(PRC2)相互关联。PRC2结合位点附近一般伴随着丰富的H3K27me3修饰澳洲幸运5正规官网网址,H3K27me3修饰会抑制SETDB1修饰H3K9me3。通过SETDB1敲除,发现H3K27me3减少,神经分化得到促进。

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    3.3 案例实验图

           

           


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