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    CUT&Tag/CUT&RUN
    CUT&Tag/CUT&RUN

    一澳洲幸运5正规官网网址、产品概述

    CUT&TagCleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag)是一种研究蛋白质与DNA互作的新方法澳洲幸运5正规官网网址。该方法通过分子生物学手段将高活性的Tn5转座酶与Protein A融合,并装载建库接头引物形成pA-Tn5转座复合物。在抗体的引导下该pA-Tn5转座复合物可靶向切割目的蛋白附近的DNA序列澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。与传统ChIP-Seq相比澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,该技术无需交联与超声打断操作,规避了其所引起的抗原决定簇遮盖和样本损失问题澳洲幸运5正规官网网址,提高了信噪比澳洲幸运5正规官网网址,并使所需细胞量减少(可低至60个)澳洲幸运5正规官网网址。与CUT&Run相比澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,该技术在pA-Tn5转座复合物进行切割时在切割片段的两端加上接头序列澳洲幸运5正规官网网址,可直接PCR建库澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,无需末端抹平和接头连接的操作澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,省时高效澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。

    CUT&Tag技术可从基因组范围内检测组蛋白、RNA polymerase II和转录因子等蛋白质结合的DNA区端澳洲幸运5正规官网网址,应用于临床和科研的表观遗传学研究澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址“闹扌以?正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址;蚴墙岷仙镄畔⒀Х治?,找到转录因子下游调控的靶基因澳洲幸运5正规官网网址,为进一步阐明生物学机制提供依据澳洲幸运5正规官网网址。   

    CUT&RUN,全称为cleavage under targets and release using nuclease澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,由美国Fred Hutchinson癌症研究中心的Steven Henikoff团队开发澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。该技术的主要特点是,它可以在完整的细胞或细胞核上进行澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,无需甲醛固定或超声处理澳洲幸运5正规官网网址。细胞经过透化处理(扩孔)后与目标抗体孵育澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,抗体进入核内与目标蛋白结合澳洲幸运5正规官网网址;细胞再与蛋白A/G连接的MNase孵育澳洲幸运5正规官网网址,目标抗体Fc段结合Protein A-MNase或Protein A/G-MNase澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。然后激活MNase酶切割结合位点两边的染色质澳洲幸运5正规官网网址,这些经过切割的片段扩散到细胞核外澳洲幸运5正规官网网址,而未切割的部分留在核内澳洲幸运5正规官网网址,可大大降低背景澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。之后从上清液中收集DNA片段并测序澳洲幸运5正规官网网址。

     

    二澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、实验流程

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    CUT&Tag

    细胞先与包被刀豆蛋白A的磁珠(Concanavalin A-coated magnetic beads, ConA beads)吸附结合澳洲幸运5正规官网网址,方便后续操作澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。用非离子去污剂洋地黄皂苷(Digitonin)进行细胞穿孔后澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,依次孵育针对靶蛋白的一抗、相应的二抗、pA-Tn5融合蛋白。其中pA-Tn5中的pA可以识别二抗的Fc区域澳洲幸运5正规官网网址,Tn5酶在加入Mg2+后定向切割靶蛋白附近的DNA序列澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。且Tn5酶进行切割时会在切割片段的两端加上接头序列,因此切割产物可以直接PCR扩增建库澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,经纯化后用于高通量测序澳洲幸运5正规官网网址。


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    未固定的核(1)栓在lectincoated磁珠上澳洲幸运5正规官网网址;

    (2)先后与抗体和蛋白A-MNase(pA-MN)孵育,其次是简单的洗涤澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址;

    (3)在冰上与Ca++混合澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,启动裂解反应澳洲幸运5正规官网网址,之后利用螯合作用停止数秒到数分钟澳洲幸运5正规官网网址;

    (4)离心包含释放的TF-DNA复合物的上层清液澳洲幸运5正规官网网址,从而进行恢复澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址。

    (5)提取上清液中的DNA澳洲幸运5正规官网网址,建库测序澳洲幸运5正规官网网址。

     

    三澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、应用范围

    一般使用新鲜细胞澳洲幸运5正规官网网址、梯度冻存细胞、新鲜组织或是冰冻组织进行实验澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,可以广泛应用于哺乳动物的蛋白与DNA互作研究澳洲幸运5正规官网网址。酵母和植物等生物类型可经由破除细胞壁或者提取细胞核来进行实验澳洲幸运5正规官网网址。

     

    四澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址、技术优势

    实验材料无需交联,原位(In situ)操作澳洲幸运5正规官网网址;

    信噪比高澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,所需测序深度减少,性价比高澳洲幸运5正规官网网址;

    实验可重复性好澳洲幸运5正规官网网址;

    省时高效澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,从细胞收集到测序文库构建仅需1-2天澳洲幸运5正规官网网址。

     

    五澳洲幸运5正规官网网址、客户文章

    Telomere-to-telomere assembly of a fish Y chromosome reveals the origin of a young sex chromosome pair.(Genome biol.IF=13.584.2021)

    该研究结合三代测序和Hi-C数据从染色体层面上有效地组装大刺鳅单倍型基因组澳洲幸运5正规官网网址。该基因组包含大多数染色体的亚端粒和着丝粒周围异染色质序列澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址澳洲幸运5正规官网网址,包括X和Y染色体。SLR位于着丝粒周围区域,表明祖先的低重组区域可以产生SLR而不需要选择重组抑制。

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